Tehnici de puncție și biopsie a măduvei osoase la primate non-umane: concentrare pe aplicarea acului de biopsie

Primatele non-umane (NHP) sunt animale experimentale de bază pentru cercetarea preclinică în hematologie, dezvoltarea medicamentelor cu celule stem, explorarea mecanismului imunitar și studiile de medicină translațională. Probele de-înaltă calitate, contaminare scăzută- și probe complete de măduvă osoasă sunt premisa și fundamentul datelor experimentale fiabile. Puncția măduvei osoase și biopsia nucleului sunt cele mai populare tehnici in vivo de prelevare a măduvei osoase pentru primatele non-umane. Spre deosebire de colectarea sângelui venos obișnuit, această tehnologie se bazează pe ace profesionale de biopsie goale, dure, pentru a pătrunde în osul cortical al oaselor lungi și a oaselor plate și pentru a obține lichid calificat de măduvă osoasă și țesuturi intacte ale miezului măduvei osoase din cavitatea medulară. Întreaga operație depinde în mare măsură de specificațiile de performanță, de potrivirea modelului și de aplicarea standardizată a acelor de biopsie a măduvei osoase. Combinat cu protocoale de experimente cu animale mature și experiență din literatură, acest articol elaborează în mod sistematic specificațiile complete-de operare a procesului de puncție și biopsie a măduvei osoase NHP, concentrându-se pe caracteristicile de selecție, avantajele aplicației și elementele esențiale de operare standardizată ale acelor de biopsie dedicate, pentru a oferi îndrumări tehnice standardizate pentru cercetătorii experimentali.

Principiul tehnic de bază al puncției și biopsiei măduvei osoase la primatele non--umane este în concordanță cu sistemul clasic de prelevare a măduvei osoase canine (Crow et al., 2009). Logica de bază este de a folosi ace de biopsie goale rigide pentru a sparge bariera osoasă corticală dură, pentru a localiza cu precizie cavitatea medulară și pentru a obține lichid de măduvă osoasă și specimene de miez solid prin aspirație cu presiune negativă și înglobare cu tăiere rotativă. În funcție de caracteristicile anatomice ale NHP, locurile comune de prelevare sunt împărțite în zonele membrelor anterioare și ale membrelor posterioare. Locurile prioritare de prelevare a membrelor posterioare includ creasta iliacă și fosa trohanterică femurală (Wolf & White, 2012), care sunt potrivite pentru majoritatea modelelor de primate de dimensiuni medii și mari-; locul alternativ al membrelor anterioare este tuberculul humeral mare, cu poziție anatomică superficială și funcționare convenabilă, potrivit pentru prelevarea suplimentară și experimentele de prelevare repetă. Diferitele locuri de prelevare au diferențe în grosimea osului, diametrul cavității medulare și acoperirea țesuturilor moi, care trebuie să fie corelate cu specificațiile corespunzătoare ale acelor de biopsie a măduvei osoase pentru a asigura eficiența prelevării și calitatea specimenului.

Ca o operație osoasă invazivă, puncția și biopsia măduvei osoase NHP vor provoca o stimulare clară a țesuturilor și un răspuns la durere. Pentru a asigura bunăstarea animalelor și funcționarea experimentală stabilă, toate operațiunile de prelevare trebuie efectuate sub anestezie standardizată. Cercetătorii pot selecta anestezia generală sau anestezia locală țintită în funcție de ciclul experimental, frecvența de prelevare și starea individuală a animalului, astfel încât să se obțină suficientă analgezie intraoperatorie și postoperatorie. În plus, întregul proces trebuie să respecte cu strictețe specificațiile experimentale sterile, inclusiv bărbierirea preoperatorie și pregătirea pielii a zonei de prelevare, dezinfecția multi-standard cu povidon-iod și alcool, așezarea prosoapelor sterile și purtarea de mănuși și instrumente chirurgicale sterile, pentru a evita eficient infecția locală, inflamația suboperatorie a rănilor și alte complicații postoperatorii repetate care afectează experimentele.

Avantajele de clasificare, selecție și performanță ale acelor speciale pentru biopsie de măduvă osoasă

Acul de biopsie a măduvei osoase este instrumentul de bază de precizie al prelevării de măduvă osoasă NHP, care determină rata de succes a unei-puncții, integritatea probei și gradul de contaminare a sângelui periferic. În prezent, există mai multe modele comerciale mature de ace speciale de prelevare a măduvei osoase pentru animale de experiment, inclusiv acul Rosenthal, Klima, Illinois sternal/iliac și acul Jamshidi. Fiecare model are un design diferențiat în ceea ce privește lungimea acului, diametrul ecartamentului, structura miezului interior și mânerul de mână, adaptându-se la diferite tipuri de corp de animale, caracteristici anatomice osoase și scopuri experimentale de prelevare.

Dintre toate tipurile de ace, cel14G Jamshidi ac pentru biopsie de măduvă osoasăeste standardul de aur pentru biopsia miezului măduvei osoase NHP, care este cea mai recomandată specificație pentru operațiile experimentale. Acest tip de ac de biopsie adoptă o structură goală rigidă optimizată, cu un stilt central solid asortat. Corpul acului are duritate și duritate moderată, care poate pătrunde eficient în osul cortical al primatelor fără a se îndoi sau aluneca. Muchia tăietoare în spirală de la vârful acului poate încorpora și intercepta în mod stabil țesuturile complete ale miezului măduvei osoase, evitând fragmentarea specimenului și deteriorarea extrudarii țesuturilor cauzate de tipurile de ace neprofesioniste. În comparație cu acele de aspirație cu calibre subțire-, acul de biopsie 14G Jamshidi are un diametru mai mare al cavității interioare, care poate obține probe de miez de volum suficient-asigurând în același timp siguranța, satisfacând nevoile de detectare morfologică, secționare a țesuturilor și analiză experimentală a indicelui biopsiei. În comparație cu acele groase supradimensionate, poate reduce eficient traumatismele osoase excesive și sângerările intraoperatorii, echilibrând calitatea specimenului și utilizarea repetabilă la animale.

Toate acele speciale pentru biopsie de măduvă osoasă sunt proiectate cu un stilt central potrivit, care este o caracteristică structurală cheie diferită de acele obișnuite de injectare. Stiletul poate bloca complet cavitatea goală a corpului acului în timpul puncției, poate împiedica țesutul moale al pielii și resturile osoase să intre în cavitatea acului pentru a bloca conducta și să asigure progresul lin al aspirației ulterioare cu presiune negativă și a tăierii țesutului central. În experimentele de eșantionare repetate, cercetătorii trebuie să selecteze specificațiile acului în funcție de greutatea corporală a animalului și dimensiunea oaselor: ace de biopsie scurte și fine pentru primate mici (greutate corporală mai mică de 5 kg) și ace Jamshidi de lungime medie de 14G convenționale pentru indivizi medii și mari, realizând potrivirea precisă a echipamentelor și obiectelor experimentale.

Precauții preoperatorii cheie pentru prelevarea cu ac de biopsie

Pentru a evita coagularea probei, hemoliza și contaminarea și pentru a îmbunătăți rata calificată a probelor experimentale, înainte de prelevare trebuie implementate specificații standardizate de pretratare și operare pentru acele de biopsie. Primul,anticoagularea cu heparină pretratamentul acelor și seringiloreste obligatoriu. Înainte de utilizare, extrageți o cantitate mică de soluție de heparină pentru a spăla peretele interior al acului de biopsie și al seringii potrivite și descărcați complet lichidul rezidual, formând un strat uniform de anticoagulant cu heparină pe peretele interior al cavității acului. Această operație poate preveni în mod eficient coagularea rapidă a fluidului măduvei osoase după prelevare, poate evita eșecul preparării frotiului și detectarea celulelor cauzate de coagularea specimenului și este pasul cheie de pretratare pentru achiziția de lichid de-calitate înaltă a măduvei osoase.

În al doilea rând, pentru experimente pe termen lung cu eșantionare repetată pe animale,selectarea rotativă a locurilor de puncțiear trebui adoptate pentru a evita puncția repetată într-un singur loc, care poate duce la hiperplazie osoasă corticală, aderență locală a țesuturilor și rezistență crescută la puncție, ducând la eșecul prelevării și la creșterea traumei animalelor. În ceea ce privește schema de analgezie, injectarea analgezică locală în piele și în țesutul moale profund al locului de puncție este superioară anesteziei generale simple, care poate ameliora eficient durerea și disconfortul postoperator al plăgii, poate reduce răspunsul la stresul animalului și poate facilita recuperarea postoperatorie și experimentele repetate ulterioare.

În ceea ce privește controlul volumului de prelevare, limitat de capacitatea cavității acului de biopsie și de volumul de sânge fiziologic al animalelor de experiment, volumul de prelevare a unui singur loc de puncție nu trebuie să depășească 2 ml. Extracția excesivă va duce la o diluare gravă a sângelui periferic, va reduce proporția de celule nucleate și de țesuturi active ale măduvei osoase din specimen, va interfera cu rezultatele de detecție experimentală și va afecta acuratețea analizei indicelui hematologic și a observației morfologice a țesuturilor.

Procedura operațională standard pentru puncția creastei iliace (operația cu ac de biopsie centrală)

Creasta iliacă este cel mai convențional și preferat loc de prelevare pentru biopsia măduvei osoase de primate non--umane, cu os cortical gros, țesut hematopoietic bogat în cavitatea medulară și puține organe importante adiacente, având o siguranță ridicată și o rată mare de succes a prelevării. După ce animalul este complet anesteziat, plasați-l într-o poziție culcat, pliați ambele membre inferioare sub abdomen pentru a ridica osul șoldului și expuneți complet zona de prelevare a creastei iliace. Majoritatea primatelor non-umane au păr rar în zona crestei iliace, care necesită doar bărbierit simplu și pregătire a pielii. Pielea este dezinfectată alternativ cu povidon-iod și alcool și este așezat un prosop steril pentru a izola zona chirurgicală și a asigura funcționarea sterilă.

După confirmarea limitei crestei iliace prin palpare, faceți o incizie mică a pielii cu o lamă chirurgicală sterilă pe partea anterioară a crestei iliace pentru a reduce rezistența la frecare a acului de biopsie în timpul penetrării. Aliniați acul de biopsie 14G Jamshidi cu incizia, avansați încet spre marginea dorsală anterioară a crestei iliace, mențineți corpul acului perpendicular pe planul crestei iliace tot timpul și aplicați o presiune continuă și stabilă în jos în timp ce rotiți corpul acului în sensul acelor de ceasornic. Poziția de inserare verticală a acului este cheia biopsiei de succes, care poate asigura că vârful acului intră cu precizie în cavitatea medulară, poate evita penetrarea oblică care duce la despicarea osului cortical și deteriorarea țesutului adiacent și poate maximiza performanța de tăiere și prelevare a vârfului acului de biopsie.

Când corpul acului pătrunde în osul cortical, operatorul va simți în mod evident reducerea bruscă a rezistenței la penetrare, iar acul de biopsie poate fi fixat stabil în țesutul osos fără a se agita, indicând că vârful acului a intrat cu succes în cavitatea medulară. În acest moment, trageți complet stilul central, conectați o seringă sterilă de 10 ml la coada acului de biopsie și aplicați o presiune negativă stabilă trăgând pistonul. Măduva osoasă proaspătă a primatelor este roșu închis și spumoasă, cu vâscozitate mai mare decât sângele periferic și conține țesut osos trabecular mic-deschis, care este un specimen calificat de măduvă osoasă.

Dacă nu se extrage lichid de măduvă osoasă, nu trageți orbește corpul acului. Rotiți acul de biopsie cu 90 de grade -180 de grade pentru a regla intervalul de tăiere și prelevare a vârfului acului; dacă încă nu este valabil, reintroduceți stilul, ajustați ușor adâncimea corpului acului înainte sau înapoi și aplicați din nou presiune negativă. Pentru probele experimentale de diagnosticare, volumul de eșantionare al unui singur loc este controlat cu 1 ml pentru a asigura puritatea probei; dacă este necesar un volum mare de probe de măduvă osoasă pentru experimente, se selectează mai multe locuri de puncție pentru prelevare în loc de extracție excesivă la un singur loc. După prelevare, scoateți rapid acul de biopsie, aplicați hemostază de compresie directă pe locul puncției pentru o lungă perioadă de timp și suturați pielea cu sutură cu un singur fir dacă apare sângerare persistentă.

Operația de puncție și biopsie a fosei trohanterice femurale și a capătului proximal humeral

Fosa trohanterică femurală este un loc ideal de prelevare suplimentară pentru primatele mici non-umane-(greutatea corporală<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

Humerusul proximal este un alt loc alternativ de prelevare eficient. Diametrul osului lung humeral este mai mare, iar cavitatea medulară este mai largă și mai puțin adâncă, ceea ce face ca poziționarea acului de biopsie să fie mai precisă și operația mai simplă. Așezați animalul în poziție laterală, țineți membrul anterior proximal, palpați șanțul intertubercular dintre tuberculii mari și mici humerali, introduceți acul de biopsie spre diafisa humerală pentru a intra în cavitatea medulară. Acest site are cerințe scăzute pentru precizia corpului acului, rata scăzută de eșec la puncție și este potrivit pentru prelevarea rapidă de probe și experimente pe animale în loturi.

Metoda de perfuzie a oaselor lungi și acul de biopsie centrală{0}}Aplicare în profunzime

Spre deosebire de puncția convențională cu un singur ac, metoda de perfuzie a osului lung (Kushida și colab., 2000) este o tehnologie de prelevare de probe de măduvă osoasă de-puritate înaltă, potrivită pentru experimente de-înaltă precizie, care necesită utilizarea în cooperare a două ace de biopsie a măduvei osoase. Operația trebuie să introducă ace de biopsie potrivite în cavitatea medulară, respectiv, la ambele capete ale diafisului osos lung, să injecteze încet soluție salină normală sterilă printr-un ac de biopsie și să colecteze măduva osoasă-conținând perfuzatul într-un recipient steril închis prin tubul de prelungire conectat la celălalt ac. Acest mod de prelevare cooperativă cu ace duble evită în mod eficient contaminarea sângelui periferic în puncția convențională, iar specimenele de măduvă osoasă obținute au o puritate mai mare, ceea ce este potrivit pentru separarea celulelor stem, culturi in vitro și experimente de detecție omică de înaltă-precizie.

Operația diferențiată a aspirației măduvei osoase și a biopsiei centrale pe baza acelor de biopsie

Aspirația măduvei osoase și biopsia miezului au același loc de prelevare și echipamentul acului de biopsie, dar logica de operare a acului postoperatorie este complet diferită, ceea ce determină cele două tipuri de specimene experimentale: lichid lichid de măduvă osoasă și țesut solid de miez de măduvă osoasă. Înaspiratia maduvei osoase, după ce acul de biopsie este fixat în cavitatea medulară, scoateți stilul și conectați o seringă pentru a aplica presiune negativă pentru a extrage lichidul lichid de măduvă osoasă, care este utilizat pentru numărarea celulelor, morfologia frotiului și detectarea citometriei în flux.

Înbiopsie miez de măduvă osoasăconcentrându-se pe specimenele de țesut, după scoaterea stiltului, acul de biopsie Jamshidi este avansat cu 1–2 cm în cavitatea medulară prin presiune stabilă și rotație lentă. Muchia tăietoare în spirală de la vârful acului poate înveli complet țesutul central al măduvei osoase. Apoi slăbiți corpul acului prin rotire și balansare, retrageți ușor și reintroduceți pentru a separa partea inferioară a țesutului central de trabecula osului. După ce ați confirmat că țesutul este complet separat, trageți integral acul de biopsie prin tracțiune rotativă. În cele din urmă, împingeți specimenul solid intact de miez de măduvă osoasă din cavitatea acului cu un împingător liniar și fixați-l cu formol 10% pentru secțiunea de țesut și analiza patologică.

Concluzie

Aplicarea standardizată a acelor de biopsie a măduvei osoase este cheia de bază a succesului experimentelor de puncție și biopsie a măduvei osoase de primate non--non-umane. Acul de biopsie 14G Jamshidi, cu designul său structural optimizat și performanța stabilă de eșantionare, este echipamentul preferat pentru biopsia centrală NHP. Cercetătorii trebuie să selecteze specificațiile acului în funcție de tipul de corp animal și de scopurile experimentale, să pună în aplicare cu strictețe pretratamentul cu heparină, operarea sterilă și protocoalele de rotație a locului și să stăpânească tehnicile de operare diferențiată de aspirație și biopsie de bază. Selecția și operarea standardizate a acului pot îmbunătăți în mod eficient puritatea și integritatea probei, pot reduce traumatismele animalelor și erorile experimentale și pot oferi suport tehnic solid pentru cercetarea hematologiei preclinice și a medicinei translaționale bazate pe modele de primate non--umane.